SILAC-IP免疫共沉淀實驗原理
在分離純化誘餌蛋白-互作蛋白復合物過程中，不可避免地會出現非特異結合蛋白，這些蛋白會一并被質譜鑒定出來，成為假陽性的互作蛋白，影響后續挑選驗證。 傳統的判斷假陽性互作蛋白方法是：用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表，扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表，作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白，比如豐度比較高的蛋白，在對照組中也會出現，而傳統的方法就會被排除掉。
SILAC技術是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復合物分離后，混在同一管中做酶切質譜等。這樣既能鑒定到復合物蛋白，又能根據同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。
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SILAC-IP實驗技術方案
不同的實驗背景和目的需對應用不同方案，輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實驗方案：
方案一：以野生型細胞株為實驗材料
1．分別用輕、重鏈氨基酸培養細胞，取等量標記好的細胞提取蛋白質；
2．提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP；
3．混合輕、重鏈Co-IP產物；
4．胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
案二：以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽)，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。
方案三：以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養RNAi 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體 |
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